Розробка та валідація високоінформативного імуноферментного аналізу для визначення вільного простат-специфічного антигену
Проблематика. Простат-специфічний антиген (PSA) є ключовим маркером, що використовується в моніторингу пацієнтів із гіперплазією передміхурової залози, ризиком розвитку та раком передміхурової залози. Клінічна лабораторна діагностика для такого роду пацієнтів реалізується із використанням відповідн...
Saved in:
| Main Authors: | , , , |
|---|---|
| Format: | Article |
| Language: | English |
| Published: |
Igor Sikorsky Kyiv Polytechnic Institute
2019-12-01
|
| Series: | Innovative Biosystems and Bioengineering |
| Subjects: | |
| Online Access: | https://ibb.kpi.ua/article/view/185877 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Summary: | Проблематика. Простат-специфічний антиген (PSA) є ключовим маркером, що використовується в моніторингу пацієнтів із гіперплазією передміхурової залози, ризиком розвитку та раком передміхурової залози. Клінічна лабораторна діагностика для такого роду пацієнтів реалізується із використанням відповідних серологічних тестів. Засоби імуноферментної діагностики являють собою біоаналітичні продукти, на які поширюються вимоги щодо медичних виробів для діагностики in vitro. Таким чином, актуальною задачею сучасної аналітичної біотехнології є покращення біоаналітичних і техніко-економічних показників діагностичних наборів, а також їх валідація як передумова допуску такого роду продукції на ринок.
Мета. Наукове обґрунтування складу і технології отримання високоінформативного імуноферментного аналізу (ІФА) для кількісного визначення вільного PSA у сироватці (крові) людини, а також його біоаналітична валідація на момент виготовлення та закінчення строку придатності.
Методика реалізації. Для конструювання ІФА використовували раніше отриманий та охарактеризований набір моноклональних антитіл (мАт) до різних епітопів PSA. Пероксидазні кон’югати мАт синтезували методом періодатного окиснення. У роботі використано 1-й міжнародний стандарт PSA Всесвітньої організації охорони здоров’я (WHO International Standard Prostate Specific Antigen) та сироватки крові людей із різним вмістом PSA. Валідацію розробленого ІФА проводили за загальноприйнятою схемою, що застосовується для кількісних біоаналітичних методик.
Результати. На першому етапі роботи було проведено визначення оптимальної конфігурації мАт для розробки неконкурентного “сендвіч”-варіанта ІФА. Досліджувані мАт були охарактеризовані за такими показниками: активність у ІФА (відносно PSA, його комплексу з α1-антихімотрипсином (α1-ACT) та спорідненого білка каллікреїну-2), ізотип, титр, константа афінності, порівняльна епітопна специфічність, ступінь інгібування ензиматичної активності PSA, джерело походження (Balb/c чи NZB миші). З урахуванням цих характеристик було сформовано принцип використання мАт для конструювання ІФА для визначення різних форм PSA (вільна молекула та зв’язана з α1-ACT). Для різних діапазонів концентрацій PSA було оцінено доцільність сумісного використання різних мАт для визначення вільного PSA. На другому етапі роботи було проведено розробку протоколу постановки кількісного ІФА (визначення кількості компонентів реагентів, оптимальних часових і температурних показників для всіх етапів аналізу). На фінальному етапі дослідження проводили валідацію розробленого ІФА, визначаючи такі показники: діагностична специфічність, лінійність, межі виявлення та кількісного визначення (аналітична чутливість), прецизійність, правильність (точність).
Висновки. Антитіла епітопів Р2 і Р4 (і різних груп специфічності) являють собою найбільш оптимальну комбінацію для “сендвіч”-варіанта ІФА для визначення вільного PSA. Сорбційно-детекційна здатність різних пар мАт корелює з їх афінністю. Найкращими антитілами для використання для сорбції на твердій фазі були антитіла 26В9, 21В7 і 11G5 епітопу Р2 (ІІ група специфічності), а для детекції – 14С8 і 21D7 епітопу Р4 (І група специфічності). Найбільш виражені сорбційно-детекційні властивості мала пара високоафінних мАт 26В9–14С8. Сумісне використання імуноферментних кон’югатів мАт 14С8 і 21D7 приводить до підвищення чутливості при дослідженні концентрацій PSA у діапазоні 1–10 нг/мл. Валідаційні характеристики визначали на момент випуску імуноферментного набору та на момент закінчення строку придатності (1 рік). Середнє значення діагностичної специфічності становить 100,6 %. Методика є лінійною в діапазоні 0,1–30 нг/мл, невизначеність калібрувального графіка є незначущою. Розрахункова межа виявлення становить 0,001782 нг/мл, а межа кількісного визначення (аналітична чутливість) збігається з межею відтворюваності й становить 0,0054 нг/мл. Правильність (систематична похибка) становить 0,03 нг/мл і є статистично незначущою. |
|---|---|
| ISSN: | 2616-177X |